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La storia riparte alcuni mesi dopo gli avvenimenti di Asylum. Il direttore Sharp ha sfruttato gli eventi per essere eletto sindaco e dare il via alla costruzione di Arkham City: una "città prigione" che sostituisce Blackgate e Arkham in cui sono detenuti tutti i delinquenti della città, in isolamento dal resto della popolazione. La città nasce nella zona della vecchia Gotham (distrutta da un terremoto), circondandola con mura altissime. La città è difesa da un gruppo paramilitare noto come TYGER. Supervisore della città è il dottor Hugo Strange, ossesionato da Batman e a conoscenza della sua vera identità. Gordon e Wayne si oppongono politicamente alla costruzione della città.
Durante un comizio di Wayne, rivolto contro Sharp, le guardie TYGER intervengono e arrestano il miliardario trasferendolo nella città prigione. Hugo è felice di avere Batman nella struttura, ma non rivela la sua identità a nessuno. Parla però a Bruce del Protocollo 10 che entrerà in vigore in poche ore e che renderà Strange molto importante, senza però rivelare ulteriori informazioni. Wayne viene introdotto nella città.
Oswald Cobblepot, alias Pinguino, è diventato uno dei padroni della città e, venendo a sapere della presenza di Wayne, gli da il benvenuto. Wayne smette di fingere, si libera dalle manette e fugge. Contatta Alfred che gli manda un Batplano che gli sgancia la sua attrezzatura. Batman scopre che i criminali minori rischiano di morire di freddo e di fame perchè il cibo, lanciato da elicotteri, viene intercettato dai criminali maggiori. Per questo tutti cercano di entrare nelle bande dei 3 maggiori criminali: Pinguino, Joker e 2 Facce. Le guardie TYGER lasciano che questo avvenga perchè il loro compito è solo quello di impedire che qualcuno esca dalla città. Joker è il criminale più temuto anche se una malattia del sangue lo sta uccidendo. Harley Quinn fa le sue veci.
2 Facce sta creando la sua gang e, per acquisire notorietà, ha rapito Catwoman e l'ha portata al Palazzo di Giustizia dove sta inscenando un finto processo.
Batman vuole salvarla e la trova legata a testa in giù nell'aula, sopra un contenitore pieno di acido. Dent (2 Facce) fa da giudice, ma fa decidere sempre alla sua moneta truccata. Batman interviene e Catwoman ne approfitta per liberarsi e aggredire 2 Facce. Batman lo lega e lo appende sopra l'acido e scopre, interrogando Catwoman, che Strange sta organizzando qualcosa che ha a che fare con lo stesso Batman. Mentre parlano Batman vede il laser di un mirino sulla faccia di Catwoman e la salva. La donna scappa e Batman studia la balistica del colpo scoprendo che questi è partito dal vecchio campanile. Lo raggiunge e trova gli uomini di Joker e Quinn stessa. Si libera di loro e la donna fugge. Libera tutti gli ostaggi nella chiesa e parla con Aaron Cash che non ha informazioni sul protocollo 10, ma gli dice che Quinn ha rapito dei medici. Batman va sul campanile e scopre che il fucile era comandato a distanza e serviva ad attirarlo lì: la cima della torre è imbottita di esplosivo. Batman fugge mentre la chiesa salta in aria. Scopre che il segnale che comandava il fucile proviene dalle acciaierie Sionis. Batman si reca lì e scopre che proprio ci sono i medici rapiti da Quinn e che il loro scopo è curare Joker, trovando la morte in caso di fallimento. Batman salva i medici e raggiunge la stanza dove si trova Joker trovando Quinn che piange sul cadavere del suo capo. Batman la allontana e controlla che l'uomo sia realmente morto, ma alle sue spalle appare il vero Joker, col volto pieno di piaghe, che lo mette ko.
Catwoman decide di rubare una cosa che possiede Strange e cerca aiuto in Poison Ivy. Questa rifiuta di aiutarla e la imprigiona nella sua edera.
Batman si risveglia e Joker gli chiede il suo aiuto: nei mesi precedenti si era rivolto a Mr Freeze, ma questi si era improvvisamente dileguato. Batman deve ritrovarlo e, per costringerlo, gli inietta il suo sangue malato e gli spiega che ha spedito altre sacche del suo sangue ai principali ospedali di Gotham.
Le indagini portano Batman a scoprire che il dottore è prigioniero del Pinguino nel suo museo che voleva rubargli l'arma congelante. Nel museo Batman trova varie teche tra cui una con una misteriosa donna: l'incisione dice che si tratta di una misteriosa assassina che ha quasi messo KO l'organizzazione del Pinguino. Dai tatuaggi Batman la identifica come membro della Lega degli Assassini di Talia al Ghul, figlia di Ra's al Ghul. Batman prosegue combattendo contro i sicari del Pinguino e salvando alcuni poliziotti infiltrati, fino a trovare Freeze. L'uomo è senza tuta e in fin di vita in una teca che lo tiene a temperatura. Il dottore gli rivela che nella tuta c'è un chip che disabilita la sua arma criogenica: batman la trova nel museo e entra in possesso del chip. Raggiunge il Pinguino nell'Iceberg Lounge e disattiva l'arma congelante. Il Pinguino con una bomba distrugge il pavimento rivelando una stanza in cui c'è Solomon Grundy. Batman sconfigge entrambi e lascia il Pinguino nelle mani di Freeze (che nel frattempo si è ripreso la tuta) che lo imprigiona in una delle teche. Freeze dice a Batman di aver trovato una cura per Joker, ma è instabile. Serve un enzima capace di legarsi al dna e di un soggetto che testi tale enzima per anni. Batman ha la soluzione: Ra's al Ghul. L'uomo vive da 600 anni grazie alle proprietà delle Fosse di Lazzaro. Batman ha bisogno del suo sangue e segue le tracce dell'assassina di Talia, che nel frattempo si è liberata e fuggita. Nel frattempo Strange comunica, tramite gli altoparlanti in città, il countdown per l'entrata in atto del Protocollo 10.